大鼠肝S9的原代肝细胞分离方法分享

 　　肝脏是药物代谢的重要器官，体外代谢模型多以肝脏为基础。常用的体外模型有肝微粒体、大鼠肝S9、肝胞质液、原代肝细胞、肝组织切片、重组人代谢酶等。其中，原代肝细胞因具有较好的体外试验重现性，基本维持了肝脏的代谢功能，特别是较好的保留了与体内一致的酶水平，成为了体外药物试验的“金标准”，广泛应用于药物代谢与毒理学研究中。

 

　　肝细胞是高度分化的细胞，具有丰富的酶系及多种特异性功能，被广泛用于生物化学、实验性肝损伤、药代动力学、毒理学和致癌作用等研究。然而，分离并培养出高活性的原代肝细胞成为了关键步骤，分离的原代肝细胞在体外是否能够存活

 

　　目前，原代肝细胞分离常用的方法有直接剪切法、组织块消化法和两步胶原酶灌流法等。其中，两步胶原酶灌流法因其对肝细胞损伤作用较小，在胶原酶消化细胞前使用了螯合剂，提高了肝细胞的产量和活力，分离的肝细胞数量多且活力好，成为了分离原代肝细胞的经典方法。

 

　　两步胶原酶灌注法先使用无钙灌流液灌注，无钙灌流液作为预灌液，可以将肝脏内的残留血液灌注出，除去或者减少细胞间的钙离子，以减少细胞间的粘着力。经无钙灌流液灌注后再使用含酶灌流液进行灌注把组织中的细胞释放出来。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体，使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞、外环境及细胞的各种改变，这些改变对离体肝细胞修复、生长及功能有重要的促进作用，有利于肝细胞的培养。